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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 723–727
CN 31-1300/Q |
Separation
of Hydrophobic NAD(P)H Dehydrogenase Subcomplexes from Cyanobacterium
Synechocystis PCC6803
DENG
Yong, YE Ji-Yu, MI Hua-Ling*, SHEN
Yun-Gang
( State Key Laboratory of Plant
Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai
Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China )
Abstract Many
efforts have been paid to the separation of an integrated NA(D)PH dehydrogenase
(NDH) complex. Several hydrophilic subcomplexes of NDH have been purified from
the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. However, no hydrophobic NDH
subcomplex has ever been separated from cyanobacteria yet. In this paper, two
NDH subcomplexes were separated from n-dodecyl β-D-maltoside(DM)-treated
whole cell extracts of Synechocystis PCC6803 by anion exchange chromatography
and gel filtration. Both subcomplexes contained the hydrophobic subunit NdhA,
suggesting that they were hydrophobic NDH subcomplexes. Of the two
subcomplexes, only one subcomplex contained NdhH. These subcomplexes showed
NADPH-nitroblue tetrazolium (NBT) oxidoreductase activity and could
specifically oxidize NADPH when several quinone analogues were used as electron
acceptors, such as ferricyanide,
2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone (DBMIB), 2,6-dichlorophenol
indophenol (DCPIP), duroquinone, ubiquinone-0 (UQ-0), etc.
Key
words Synechocystis; NAD(P)H
dehydrogenase; hydrophobic subunit
_________________________________________
Received:
March 24, 2003 Accepted:
June 2, 2003
This
work was supported by the grants from the Major State Key Basic Research
Development Program of China (973 Program) (No. G1998010100) and the National Natural
Sciences Foundation of China (No. 30270123)
*Corresponding
author: Tel, 86-21-64042090-4513; Fax, 86-21-64042385; e-mail, [email protected]
集胞蓝藻PCC6803含疏水亚基的NAD(P)H脱氢酶亚复合体的分离
邓勇 叶济宇 米华玲* 沈允钢
( 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032 )
摘要 利用离子交换与凝胶过滤层析, 从n-dodecyl β-D-maltoside(DM)处理的集胞蓝藻Synechocystis PCC6803细胞粗提液中, 首次分离到两个包含NDH疏水亚基NdhA的亚复合体。 酶活性分析表明, 分离到的NDH亚复合体具有NADPH-氮蓝四唑(NBT)氧化还原酶活性, 以NADPH为电子供体可以还原铁氰化钾、 二溴百里香醌(DBMIB)、
二氯酚靛酚(DCPIP)、 duroquinone以及UQ-0等质醌类电子受体。
关键词 集胞蓝藻; NAD(P)H脱氢酶; 疏水亚基
集胞蓝藻Synechocystis
PCC6803的基因组包含11个ndh基因(ndhA～K)[1], 它们都编码一个与线粒体复合体I高度同源的NAD(P)H脱氢酶(NDH, EC 1.6.99.3)[2]。
在蓝藻中, NDH是一个多亚基复合体, 已知其ndhA～G和ndhH～K基因分别编码NDH的疏水亚基和亲水亚基[2,3]。
有证据表明蓝藻NDH既位于质膜也位于类囊体膜上[2], 分别介导呼吸和光合循环电子传递[4,5]。 NDH介导的电子传递参与无机碳转运系统的能化/活化[6～8]以及蓝藻对盐胁迫的适应[9,10]等生理过程。 此外, ndhH基因的缺失分析表明Ndh
H亚基对于蓝藻的生存是必需的[11]。
最近, 我们发现蓝藻中NADPH专一的NDH参与光调节的围绕光系统I的循环电子传递及呼吸电子传递, 而且NDH的活性和亚基表达也受光诱导[12]。
蓝藻NDH复合体的分离纯化比较困难。 其主要的原因是,
在分离纯化过程中常常得到几个不同的、 具有酶活性的亚复合体。
此外, 也有报道指出, 蓝藻中可能存在不同功能形式的NDH[7,13]。 至今为止,
人们还没有从蓝藻中分离到完整的NDH复合体。 Berger等[3]用免疫亲和层析的方法, 从集胞蓝藻PCC6803类囊体膜的Triton X-100溶出物中分离到一个NDH的亚复合体,
包含7条主要的多肽, 其中有Ndh
H、 I、 J、
K等亲水亚基。 Matsuo等[14]从兼性离子去污剂3-[(3-cholamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) 处理的集胞蓝藻PCC6803的细胞粗提物中, 也分离到一个对NADPH专一的NDH亲水亚复合体,
包含Ndh H、 I、
J和K亚基, 但不含Ndh
A和Ndh B等疏水亚基。 迄今, 含疏水亚基的蓝藻NDH亚复合体的分离还未见报道。
研究表明线粒体呼吸链复合体I的疏水亚复合体可能含有醌结合位点[15], 由于蓝藻NDH与线粒体复合体I有很高的同源性, 可以推测蓝藻可能也是如此,
但还没有直接的实验证据。 因此,
从蓝藻中分离NDH的疏水亚复合体对研究NDH复合体的结构与功能具有重要意义。
本文利用离子交换层析和凝胶过滤, 首次从集胞蓝藻PCC6803中分离到含疏水亚基的NDH亚复合体,
并对此亚复合体的性质进行了初步的研究。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 细胞的培养
集胞蓝藻PCC6803细胞用BG-11培养基[16](含5 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0), 在30 ℃、 连续光照(60 μEm－2s－1)下通气(含2%
CO2的空气)培养。 对数后期生长的细胞 (A730=0.4～0.6)于5000
g 离心5 min收集, 细胞以10
mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗涤一次, 再次离心, 将蓝藻细胞悬浮于含20%(体积比)甘油的10
mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中, 贮存于－80 ℃。
1.2 蛋白质的分离
细胞冻融后加入0.5
mmol/L苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl
fluoride, PMSF), 用Bead-beater细胞破碎器(Biospec, 日本)在冰浴中破碎, 每次破碎20
s, 间歇3 min, 重复5个循环。 细胞匀浆于10 000 g、
4 ℃离心5 min以除去未破碎的细胞, 上清液(细胞粗提液, 蛋白质浓度调节到25
g/L)中加入5 g/L(最终浓度)十二烷基麦芽糖苷(n-dodecyl
β-D-maltoside, DM), 冰浴中缓慢振荡1 h, 最后以140
000 g离心60 min。
离心后上清液先经DEAE-52(Whatman)离子交换柱(2.5 cm×15
cm)分离, 用含0 ～
0.5 mol/L NaCl线性梯度的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 0.5 mmol/L EDTA, 在7 ℃洗脱(流速为3 mL/min, 12 mL/管)。 得到的活性部分用Amicon YM-10超滤膜浓缩, 然后再用两支串联的Hiload
26/60 Superdex 200 prep grade凝胶过滤柱(2.6 cm×60 cm), 于10
℃在高压液相层析(FPLC)系统(Amersham Pharmacia)上分离蛋白质, 洗脱液含10
mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 0.5 mmol/L EDTA、 150 mmol/L NaCl, 流速为1 mL/min。 收集的活性部分以Amicon YM-30超滤膜浓缩后－80 ℃贮存。
1.3 NDH酶活性分析
NDH酶活性通过测量人工电子受体的还原或底物NADPH的氧化来分析[14]。 NADPH的氧化用分光光度计(岛津UV-3000)记录340
nm [ε=6.22(mmol/L)－1 ·cm－1] 光吸收的下降速率来测量,
当铁氰化钾为电子受体时记录 420 nm [ε=1.03(mmol·L)－1·cm－1]处光吸收下降速率来测量。
测量温度为室温(约25 ℃)。 1个酶活性单位为每分钟氧化1
μmol/L NADPH的酶量。
1.4 非变性凝胶电泳及活性染色
凝胶过滤分离到的活性部分直接进行非变性凝胶电泳(native-PAGE)分析, 按Davis等[17]的方法用7.5%聚丙烯酰胺凝胶于4 ℃下进行。 活性染色时将凝胶于室温、 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)中缓慢摇动5 min, 然后暗中加入含1
g/L氮蓝四唑(NBT)及1 mmol/L NADPH的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 直至紫色条带呈现。
1.5 蛋白质的洗脱、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫印迹分析
将多个非变性凝胶上的活性条带切下后, 置于约1倍凝胶体积的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% (体积比) Triton X-100和0.1 g/L SDS中30
℃振荡过夜, 然后10 000 g离心10
min, 上清液以15% SDS-PAGE分离并用于免疫印迹分析。 Ndh A抗体由Asada教授(日本福山工业大学)惠赠, Ndh H抗体由Ogawa教授(日本名古屋大学)惠赠。
Fig.1 Separation of NDH from the whole cell extracts of Synechocystis PCC6803
(A)
Anion exchange chromatography. (B) Gel filtration.
Table 1 Procedure of the separation of NDH Purification step〖〗 Protein
|
Purification
step |
Protein (mg) |
Total
activity (μmol NADPH min-1ml-1) |
Specific
activity [μmol NADPH min–1
(mg protein)–1] |
Purification (fold) |
Yield (%) |
|
Crude
extract (before DM treatment) |
496 |
123 |
0.249 |
1 |
100 |
|
Crude
extract (after DM treatment) |
481 |
120 |
0.250 |
1 |
97 |
|
DEAE52 |
125 |
65 |
0.522 |
2.1 |
25 |
|
Superdex
200 |
5.5 |
29 |
5.29 |
22 |
1.1 |
2 结果(Results)
NDH复合体的分离过程见表1。
蓝藻细胞粗提液经5 g/L DM增溶后, 经离子交换层析分离,
集中在0.18～0.31 mol/L NaCl梯度洗脱范围分离到一个主要的NADPH-铁氰化钾氧化还原酶活性峰[图1(A)]。 将这部分活性峰处的蛋白质再经凝胶过滤层析分离后, 得到四个不同分子量的酶活性部分[图1(B)]。
由于我们希望得到分子量尽可能大的NDH亚复合体, 因此我们主要对图1(B)中的第一个活性峰进行了分析。 第一个活性峰的蛋白质经非变性凝胶电泳及活性染色后, 主要出现了三条活性条带,
分子量分别为240 kD (带I)、
200 kD (带II)和100 kD (带III),
考马斯亮蓝染色后在相同位置有对应的三条蛋白质带。 由于带III分子量较小, 活性较低,
而且其量随带I和带II的变化而变化
(图2), 因此我们推测它可能是从带I或者带II降解下来的, 然而也不能排除其是另一种NDH亚复合体的可能。 带I、 II和III都不能氧化NADH(数据未列出),
表明我们分离得到的复合体是NADPH专一的。
Fig.2 Native-PAGE and NADPH-NBT
oxidoreductase activity staining of the activity peak fractions separated by
gel filtration
(A)
Stained with Coommassie brilliant blue. (B) NADPH-NBT oxidoreductase activity
staining.
带I和 II中的蛋白质切带溶出后,
SDS-PAGE 分析显示它们分别含有14和13条蛋白质带,
其中带I与带II的多肽组成大部分相同[图3(A)], 表明分子量较小的带II可能是从带I上降解来的;
然而, 也不排除它们是两种分子组成有所不同的NDH的可能。 免疫印迹分析结果显示, 带I含Ndh
A和Ndh H; 带II含Ndh
A, 但不含Ndh H[图3(B)]。 此外, 从图3(A)可以看出有三条很浓的蛋白质带, 分子量分别为48
kD、 21 kD和18 kD, 分别与相应藻胆体蛋白的分子量一致[18]。 我们在另一份工作中发现蓝藻中NDH与藻胆蛋白结合在一起(未发表数据), Matsuo等[14]在分离的蓝藻NDH中也发现藻胆蛋白的存在,
因此我们推测这三种蛋白质可能为藻胆体蛋白。 在这两个NDH亚复合体中, 我们没有检测到Ndh
B、 Ndh K及铁氧还蛋白-NADP+ 氧化还原酶(FNR)的存在。 此外, 在离子交换层析前, 用非变性凝胶电泳及活性染色分析了细胞粗提液, 我们检测到一个300
kD的NDH亚复合体, 含有Ndh
A、 Ndh B和Ndh H(数据未列出),
然而本文中分离到的两个NDH亚复合体都不含Ndh B, 我们推测Ndh
B可能在分离过程中从NDH复合体上脱离下来了。
由带I和带II在离子交换、 凝胶过滤层析及电泳中的行为可以看出它们在分子量及电荷等蛋白质性质上非常接近, 用本实验中采用的离子交换、 凝胶过滤层析方法我们无法把它们分开; 尽管非变性电泳可以将他们分开, 但在从胶上洗脱蛋白质时, NDH亚复合体降解严重。
此外, 我们还发现, NDH的结构很不稳定,
细胞粗提液于30 ℃处理1 h, 300 kD的NDH即大部分消失, 同时伴随240
kD和200 kD两条NDH活性条带的增加,
其分子量大小分别对应带I和带II(数据未列出)。
因此我们推测带I和带II都是从300
kD的NDH上降解下来的。 同时, 由于带I和带II在亚基组成上非常相近[图3(A)],
而且它们均具有氧化NADPH和还原醌类似物的活性(图2),
推测它们在降解过程中可能都没有丢失反应中心的亚基, 因此它们在酶活性性质上可能相同, 所以我们在混合条件下对这两个NDH亚复合体的分子性质进行了研究。 当以铁氰化钾为电子受体时,
分离到的含疏水亚基的NDH亚复合体对NADPH的Km为6.5 μmol/L,
Vmax为每毫克蛋白质8单位, 均高于他人用亲水亚复合体得到的结果[14]。
Fig.3 Analysis of Band I and Band II
(A)SDS-PAGE. (B) Western
blotting.Fig.4NADPH oxidation activity of NDH subcomplex with different
electron acceptors. 1, 200 μmol/L
O2; 2, 100 μmol/L
duroquinone; 3, 100 μmol/L
DMBQ; 4, 100 μmol/L
DBMIB; 5, 1 mmol/L FeCy; 6, 100 μmol/L
DCPIP; 7, 100 μmol/L
UQ-0; 8, 100 μmol/L
menadione; 9, 100 μmol/L
decylubiquinone; 10, 100 μmol/L
PQ.
研究了分离的NDH亚复合体对不同电子受体的NADPH氧化活性(图4), 结果表明对铁氰化钾有最高的活力, 依次为二溴百里香醌(DBMIB)、
二氯酚靛酚(DCPIP)及2,6-二甲基苯醌(2,6-dimethyl-p-benzoquinone,
DMBQ)等。 这与NDH亲水亚复合体的情况相似 [14]。 然而, 其对维生素K3
(menadione) 的还原活性却远小于亲水亚复合体, 而当质醌 (PQ)、 癸基泛醌(decyllubiquinone)及O2为电子受体时,
则几乎检测不到NADPH氧化活性。
3 讨论(Discussion)
迄今,
人们只分离到几种NDH亲水亚复合体[3,14], 含疏水亚基的蓝藻NDH亚复合体的分离至今还未见报道。 本文中,
我们分离到两个含疏水亚基Ndh A的NDH亚复合体,
其中一个亚复合体还含有Ndh H亚基, 而另外一个则不含Ndh
H。 尽管Ndh
H对集胞蓝藻的生存是必需的[11], 但我们的结果表明NdhH丢失后并不影响NDH在体外的NADPH氧化活性(图2, 3)。 此外, 我们未能在分离得到的两个NDH亚复合体中检测到Ndh B及Ndh
K亚基的存在(数据未列出), 这表明Ndh
B与Ndh K对于NDH的体外NADPH氧化活性也不是必需的。 至于我们分离的NDH亚复合体是否还含有其他亚基, 还需做进一步的分析。
本文中所用的分离方法与Matsuo等[14]所采用方法的主要差别在于破碎方法和去垢剂不同, 这可能是我们能够分离到含疏水亚基的NDH亚复合体的主要原因。
有文献报道,
高等植物叶绿体中NDH与FNR相互结合在一起[19,20]。
然而, 至今还没有证据表明蓝藻的NDH与FNR有相互作用。 本文中, 我们分离到的NDH亚复合体均不含FNR,
这表明, 至少在我们的实验条件下, NDH与FNR并不结合在一起。
分离到的NDH亚复合体可以氧化NADPH, 但不能氧化NADH,
表明其是NADPH专一的。 对此两个NDH亚复合体的NADPH氧化活性分析表明它可以还原醌的类似物。
然而对PQ的还原活性却非常低, 几乎不能测到(图4), 这可能是由于实验系统中PQ的水不溶性引起的, 但也可能其反应另需其他亚基的存在。 Matsuo等[14]分离到的NDH亲水亚复合体对PQ的还原活性也非常低, 他们将其原因归咎于疏水亚复合体的解离。
线粒体呼吸链复合体I主要由带有NADH结合位点的亲水亚复合体和带有醌结合位点的疏水亚复合体组成[15], 推测集胞蓝藻可能也是如此,
但还没有直接的实验证据。 有报道指出,
Ndh A可能是醌的结合位点[21]。
与Matuso等[14]分离到的亲水亚复合体相比较, 本文中分离的NDH疏水亚复合体对除PQ、 维生素K3外的醌类似物都具有较高的还原活性, 这可能与Ndh A等疏水亚基的存在有关。 令人奇怪的是,
前人分离的亲水亚复合体尽管自称不含Ndh A, 但仍具有还原醌的能力[14], 这也许表明蓝藻中Ndh
A可能并不是醌的结合位点或者还存在其他的醌结合位点, 然而也不排除他们分离的亲水亚复合体含有痕量的Ndh A或其他未检测的亚基的可能。 大肠杆菌
(E. coli) 中含有FMN和铁硫簇的Nuo F亚基是可能的NADH结合位点, 然而在蓝藻和高等植物的叶绿体中还未发现同源的亚基[21]。 从蓝藻中分离纯化NDH疏水亚复合体以及进而分离纯化完整的NDH复合体对阐明NDH复合体的结构与催化机制将具有重要意义。
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